荧光原位杂交技(fish)原理:是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交,通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号,来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布,或者是结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位。
荧光原位杂交技(fish)实验步骤:
1、组织固定:组织取出洗净后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。
2、脱水:组织固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡,包埋。
3、切片:石蜡经切片机切片,摊片机捞片,62°烤箱烤片2h。
4、石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲1苯Ⅰ 15min-二甲1苯Ⅱ 15min-无水乙醇Ⅰ 5min-无水乙醇Ⅱ 5min,风干,DEPC水浸泡。
5、消化:根据组织固定时间长短,切片于修复液中煮沸10分钟,自然冷却。后基因笔画圈,根据不同组织不同指标特性,滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20min。纯水冲洗后PBS洗3次×5min。
染色体发现距今已有150多年的历史,染色体检测被广泛用于动、植物及人类的细胞遗传学研究,随着染色体分技术和分子生物学技术的发展。染色体研究范围也不断扩大,特别是用于肿1瘤分子诊断。肿1瘤细胞的染色体变化是一非常普遍的现象,可分为原发和继发两类。在肿1瘤形成的生物学基础方面,原发性的染色体变化与引起肿1瘤的直接原因有关,肿1瘤细胞中可以发现各种形式的染色体畸变,如缺失、重复、易位、重排、单体断裂及核内复1制等;继发性变化主要是肿1瘤细胞核型的改变。染色体的检测对于肿1瘤的诊断、鉴别诊断、生物学行为判别等方面都重要意义。染色体的检测方法进展很快,检测的精1确率也不断提高,水稻种子是人类重要的食物来源,其发育涉及一个复杂的调控网络,其中转录因子发挥了关键作用。MADS转录因子家族成员是植物花器1官发育的重要调控因子,已有的研究表明,染色体原位杂交检测技术服务,几乎所有的水稻MADS基因都在种子中表达,但对MADS家族成员参与水稻种子发育调控的研究结果仍比较少。
在这项研究中,研究组基于前期的表达谱研究基础,分析得到了一个在水稻生殖发育阶段优先表达的转录因子MADS29。细致分析表明,MADS29在花药、胚珠和种子中均表达,且在受精后的母体组织表达量高。MADS29的反义转1基因植株呈现种子皱缩、淀粉粒形态异常、灌浆速率下降等表型。通过解剖学切片、末端转移酶标记实验和全基因组表达谱芯片分析等,研究人员证明了MADS29通过调控程序化死1亡(PCD)过程促进珠心细胞和珠心突起处的降解。进一步的体外凝胶阻滞实验显示,MADS29能够通过直接结合程序化死1亡相关基因的启动子区域而调控其表达,进而影响胚乳发育。
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